Με τον όρο θρομβοφιλία ονομάζουμε τη διαταραχή στην πήξη του αίματος (υπερπηκτικότητα) που έχει σαν αποτέλεσμα το μη φυσιολογικό σχηματισμό θρόμβων. Η θρομβοφιλία οφείλεται σε κληρονομικούς ή επίκτητους παράγοντες. Οι κληρονομικοί παράγοντες σε συνδυασμό με άλλους όπως παχυσαρκία και κάπνισμα, αυξάνει την προδιάθεση για καρδιαγγειακές παθήσεις όπως φλεβική θρόμβωση ή πνευμονική εμβολή. Κατ’ επέκταση η θρομβοφιλία μπορεί να προκαλέσει μαιευτικές επιπλοκές όπως επαναλαμβανόμενες αποβολές, αποκόλληση του πλακούντα ή ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης εμβρύου.

Με τον μοριακό έλεγχο θρομβοφιλίας διερευνούμε τους κληρονομικούς παράγοντες, δηλαδή τις μεταλλάξεις που προέρχονται από τους γονείς. Έχει παρατηρηθεί ότι πάνω από το 90% των φορέων αυτών των μεταλλάξεων δεν θα αναπτύξουν ποτέ θρόμβωση. Ωστόσο ο έλεγχος προδιάθεσης δημιουργίας θρομβώσεων θα πρέπει να συνεκτιμά και το οικογενειακό ιστορικό (συγγενείς α’ βαθμού με ιστορικό θρομβώσεων).

Σε περίπτωση εγκυμοσύνης, ο έλεγχος κινδύνου εμφάνισης θρομβοεμβολικού επεισοδίου αποσκοπεί στην λήψη αποφάσεων για προφυλακτική αντιπηκτική αγωγή με Ηπαρίνη Χαμηλού Μοριακού Βάρους. Όσον αφορά στον γενετικό έλεγχο, ο κίνδυνος επιπλοκών σχετίζεται κυρίως με τις μεταλλάξεις FV Leiden στον παράγοντα V και FΙΙ 20210 στον παράγοντα ΙΙ και λιγότερο με μεταλλάξεις του γονιδίου MTHFR. Σημαντικός παράγοντας κινδύνου είναι και το προηγούμενο ιστορικό θρόμβωσης τόσο στην ίδια την έγκυο (προηγούμενες θρομβώσεις, επαναλαμβανόμενες αποβολές κ.α.) όσο και στην οικογένειά της. Ο έλεγχος για περισσότερες θρομβοφιλικές μεταλλάξεις βοηθάει στην εκτίμηση κινδύνου, χωρίς όμως αυτές να αποτελούν ανεξάρτητους παράγοντες κινδύνου θρόμβωσης.

Δυνατότητες γενετικού ελέγχου θρομβοφιλίας στο εργαστήριο μας:

  • FV Leiden
  • FII R2
  • MTHFR (C677T; A1298C)
  • Έλεγχος 4 παραγόντων: Factor II (Prothrombin), FV Leiden, MTHFR (C677T; A1298C)
  • Έλεγχος 12 παραγόντων: Factor II, FV Leiden, F XIII, β-ινωδογόνο, HPA1, PAI1, MTHFR, ACE, APOB, APOE
  • PAI-1 (αναστολέας ενεργοποιητή πλασµινογόνου)
  • GPIa (Γλυκοπρωτεΐνη Ια)

Είδος δείγματος: Περιφερικό αίμα σε EDTA

 

Έλεγχος 12 παραγόντων: Factor II, FV Leiden, F XIII, β-ινωδογόνο, HPA1, PAI1, MTHFR, ACE, APOB, APOE

  1. FV Leiden (G1691A): Αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς παράγοντες κινδύνου οικογενούς θρομβοφιλίας. Προκαλεί την ενεργοποίηση της αντίστασης στην πρωτεΐνη C και παρατηρείται στο 20-50% των ασθενών με θρομβοεμβολή.
  2. FV R2 haplotype (H1299R): Αποτελεί έναν ήπιο παράγοντα κινδύνου θρόμβωσης και καρδιαγγειακών νοσημάτων.
  3. Factor II G20210A: Φορείς της μετάλλαξης έχουν 3 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο θρομβώσεων. Ο κίνδυνος αυξάνεται σε συνδυασμό με την μετάλλαξη FV Leiden. Η ύπαρξη του αλληλομόρφου αυξάνει τα επίπεδα προθρομβίνης στο πλάσμα του αίματος.
  4. MTHFR C677T: Ο πολυμορφισμός σε ομοζυγωτία αυξάνει την προδιάθεση αρτηριακής και φλεβικής θρόμβωσης σε συνδιασμό με άλλους παράγοντες κινδύνου. Προκαλεί μειωμένη ενζυμική δραστικότητα και αυξημένα επίπεδα ομοκυστεΐνης στον ορό σε συνδυασμό με έλλειψη φολικού οξέος.
  5. MTHFR A1298C: Ο πολυμορφισμός σχετίζεται επίσης με μειωμένη ενζυμική δραστικότητα. Συνδυασμένη ετεροζυγωτία των C677T και A1298C πολυμορφισμών θεωρείται παράγοντας κινδύνου καρδιαγγειακών νοσημάτων.
  6. Factor XIII (FXIII) V34L: Αποτελεί έναν προστατευτικό παράγοντα από θρομβοεμβολικά επεισόδια.
  7. PAI-1 4G/5G: Αποτελεί έναν ήπιο παράγοντα κινδύνου θρομβοεμβολής και εμφράγματος μυοκαρδίου. Ο πολυμορφισμός 4G σχετίζεται με υψηλότερα επίπεδα μεταγραφής του PAI-1 γονιδίου.
  8. Απολιποπρωτεΐνη B (Apo B) R3500Q: Σχετίζεται με σοβαρή υπερχοληστεριναιμία και αθηροσκλήρωση.
  9. Απολιποπρωτεΐνη E (Apo E) E2/E3/E4: Ο απλότυπος Ε4 σχετίζεται με αυξημένη ευαισθησία πρόωρου εμφράγματος μυοκαρδίου, ειδικά στους καπνιστές. Αποτελεί σημαντικό προβλεπτικό δείκτη των επιπέδων ολικής χοληστερόλης και LDL στο πλάσμα με τον Ε2 απλότυπο να προβλέπει μικρότερα επίπεδα και τον Ε4 υψηλότερα.
  10. β-ινωδογόνο -455 G>A: Αυξάνει τα επίπεδα ινωδογόνου στο πλάσμα και σχετίζεται με πρόωρο έμφραγμα μυοκαρδίου και ισχαιμικό εγκεφαλικό.
  11. HPA1 (1a/b): Αποτελεί παράγοντα κινδύνου πρόωρου εμφράγματος του μυοκαρδίου ειδικά για τους καπνιστές.
  12. ACE 287 bp ένθεση/έλλειψη (I/D): Αποτελεί παράγοντα κινδύνου εμφράγματος μυοκαρδίου σε ηλικιωμένους και καπνιστές. Ο απλότυπος που φέρει έλλειψη του 287bp τμήματος σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα ενεργοποίησης της ACE πρωτείνης και αυξημένα επίπεδα στο πλάσμα του αίματος.

Μέθοδος

Με τη χρήση πολυπλεκτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (multiplex PCR) σε συνδυασμό με τη διαδικασία του ανάστροφου υβριδισμού και τη χρήση σημασμένων ανιχνευτών που φέρουν ειδικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων (SSOP – PCR) ανιχνεύονται οι μεταλλάξεις και οι πολυμορφισμοί ενδιαφέροντος στα γονίδια  Factor II, FV Leiden, F XIII, β-ινωδογόνο, HPA1, PAI1, MTHFR, ACE, APOB, APOE.

Έλεγχος 4 παραγόντων: Factor II (Prothrombin), FV Leiden, MTHFR (C677T; A1298C)

Το γονίδιο της θρομβίνης κωδικοποιεί τον παράγοντα της πήξης II, μια γλυκοπρωτεΐνη εξαρτώμενη της Βιταμίνης Κ η οποία συντίθεται στο ήπαρ σε μορφή ανενεργού ενζύμου. Η μεταλλαγή της προθρομβίνης G20210A συνδέεται με αυξημένα επίπεδα θρομβίνης στη κυκλοφορία και αυξημένο κατά 3 φορές του κινδύνου εμφάνισης θρομβοεμβολισμού.

Ο παράγοντας V ανήκει σε μια ομάδα πρωτεϊνών που παράγονται από το ήπαρ και ενεργοποιούνται, με μια διαδικασία που ονομάζεται καταρράκτης πήξεως, όταν ένα αιμοφόρο αγγείο τραυματίζεται. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία θρόμβου, ο οποίος λειτουργεί σαν φραγμός στην περιοχή τραυματισμού δρώντας προστατευτικά. Ο V Leiden είναι μια μορφή του παράγοντα V ελαφρώς τροποποιημένη φέροντας αλλαγή στη σύνθεση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων στη θέση 1691 (FV G1691A). Αυτή η τροποποιημένη πρωτεΐνη αντιστέκεται στην αποδιάταξη από την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C (APC) κατά την πήξη, με αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της θρομβίνης στο αίμα και την αύξηση του ρίσκου για θρομβοεμβολισμό (VTE).

Το ένζυμο MTHFR (αναγωγάση του Μεθυλενοτετραϋδροφυλλικού/ (Methylene-tetrahydrofolatereductase) εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων και συμμετέχει στο μεταβολισμό του φολικού οξέος. Η μεταλλαγή C677T (OMIM:607093, rs1801133) του γονιδίου MTHFR κωδικοποιεί μια μορφή του ενζύμου μειωμένης δραστικότητας. Άτομα που φέρουν σε ομόζυγη μορφή τον παραπάνω πολυμορφισμό 677Τ/Τ καθώς και σε μικρότερο βαθμό διπλοί ετεροζυγώτες με τον συνδυασμό των αλληλόμορφων C677T & A1298C (OMIM:607093, rs1801131) μπορεί να εμφανίσουν υψηλά επίπεδα ομοκυστεΐνης στο πλάσμα και συνεπώς αυξημένο ρίσκο θρόμβωσης.

Μέθοδος

Γίνεται ενίσχυση ενός τμήματος του γονιδίου FΙΙ (prothrombin) και FV Leiden με χρήση ειδικά σχεδιασμένων εκκινητών (primers) μέσω PCR αντίδρασης. Ταυτόχρονα ενισχύονται εσωτερικοί ποιοτικοί μάρτυρες. Το δείγμα αναλύεται παρουσία γνωστού ετερόζυγου μάρτυρα για τη συγκεκριμένη μεταλλαγή σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Για τους πολυμορφισμούς C677T & A1298C του γονιδίου MTHFR ακολουθεί PCR- HRM (high resolution melting). Κάθε δείγμα τρέχει παρουσία θετικών μαρτύρων και αρνητικού control.

Το όριο ανίχνευσης με το συγκεκριμένο σύστημα αντιδραστηρίων είναι 6 ng γενωμικού DNA για τους παράγοντες II και V, ενώ για τον MTHFR είναι 98%.

 

Γλυκοπρωτεΐνη Ια, GPIa C807T

H Γλυκοπρωτεΐνη Ια αποτελεί μέλος του συμπλόκου υποδοχέα του κολλαγόνου στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων και συμβάλλει στον σχηματισμό θρόμβων μέσω της ενεργοποίησης και της πρόσδεσης των αιμοπεταλίων.

H ανίχνευση για τη μεταλλαγή C807T του GPIa γίνεται με τη μέθοδο ΑRMS-PCR. H ευαισθησία της συγκεκριμένης μεθόδου ξεπερνά το 98%.